Llega un momento en donde pueden preguntarte; ¿qué profundidad de cobertura requieres para tu experimento de NGS?, y en algunos casos puede que no conozcas este término. No te preocupes, en este blog te explicaremos el significado de cada concepto que necesitas saber en secuenciación, y así, domines por completo cada uno de tus proyectos enfocadas en el área de genómica.
Sin más que decir comencemos con los conceptos experimentales en secuenciación.
Es un soporte sólido de vidrio que contiene secuencias cortas de oligonucleótidos en su superficie y en el cual ocurre la química de la secuenciación.
- Adaptadores (adapters)
- Índices (indexes)
Secuencias únicas de oligonucleótidos presentes en los adaptadores que permiten identificar y asignar los datos pertenecientes a una muestra cuando se mezclan varias (ver Multiplexing).
- Genoma de referencia
Genoma que se encuentra completamente secuenciado y ensamblado y que actúa como una representación antecedente contra el cual se alinean y comparan nuevas lecturas secuenciadas.
- Modo de lectura desde un extremo (single-end)
Cada fragmento de la librería se secuencia sólo por un extremo, es una forma sencilla y económica de generar datos de secuenciación.
- Modo de lectura desde ambos extremos (paired-end)
Cada uno de los fragmentos de la librería se secuencian por ambos extremos al mismo tiempo. Esto permite generar datos se secuencias de alta calidad y precisión (es el método de mayor uso y esencial en la identificación de variantes estructurales).
- Lecturas por corrida (reads per run)
Número de fragmentos secuenciados que se generan en una corrida se secuenciación. Depende del objetivo del ensayo y de las condiciones experimentales, incluidas la calidad de la muestra, la densidad del clúster y los parámetros de corrida seleccionados.
¿Tienes dudas con las especificaciones únicas de lecturas en modo single-end o pired-end? No te preocupes ponte en contacto con nosotros y te asesoraremos de forma completa, da clic aquí y te ayudaremos a conocer mejor la plataforma illumina adecuada a tu proyecto.
- Longitud de lectura (read lenght)
Es el número máximo de bases que pueden ser secuenciadas de cada fragmento, corresponde con la incorporación de un oligonucleótido unido a un fluoróforo durante la secuenciación por síntesis -SBS. Lo podemos expresar en el modo de lectura: 1x__bp (single-end) o 2x__bp (paired-end).
- Ciclos de lectura (cycles)
Es el número máximo de pares de bases que pueden ser secuenciadas con un kit en particular (longitud de lectura total). Por ejemplo, “300 ciclos” implica que se pueden secuenciar un máximo de 300 bases en modo de lectura 1x300bp o 2x150bp. No es necesario usar todos los ciclos disponibles con cierto kit, es decir, se puede hacer una corrida 1x50bp con un kit de 75 ciclos.
- Rendimiento (output)
Cantidad de información que se obtiene por corrida. Se expresa en Megabases (Mb), gigabases (Gb) y terabases (Tb). Cada plataforma Illumina y kit de secuenciación cuentan con especificaciones únicas de rendimiento.
- Profundidad (depth, coverage)
Es el número promedio de veces que una única base fue secuenciada durante la corrida. Podemos consultar, en artículos publicados, recomendaciones de cobertura de acuerdo con el tipo de aplicación. Por ejemplo, un genoma completo secuenciado a una cobertura de 30× significa que, en promedio, cada base en el genoma fue secuenciada 30 veces. Algunos segmentos pueden leerse 100 o más veces, mientras que otros solo una o dos veces. En la secuenciación de genoma completo (WGS) siempre existirán regiones que no se lograron capturar lo que da origen a los gaps durante el ensamble.
- Multiplexar (multiplexing)
Es la combinación de múltiples muestras en una corrida para hacer uso de todas las lecturas disponibles. Esto se logra durante la preparación de la librería, agregando a las diferentes muestras, identificadores moleculares llamados índices (de 6 a 10 bp).
Ahora bien, ¿cómo podemos aplicar de forma concreta cada uno de estos términos?, aquí te dejare un ejemplo concreto y que abarca cada uno de los conceptos que platicamos anteriormente.
Ejemplo:
La plataforma MiSeq, en modo single-end, genera hasta 15 millones de lecturas únicas mientras que en modo de lectura paired-end, puede generar hasta 30 millones de lecturas. En éste modo de lectura, de forma teórica, se secuencian 15 millones de pares de bases por ambos sentidos y haciendo uso de un kit versión V2-2x250bp, el tamaño máximo de cada lectura es de 250bp lo que se expresa en 500 ciclos de corrida (2x250bp).
¿Aún tienes dudas?, contáctanos te asesoraremos de forma completa y eficaz para así poder generar con éxito cada uno de tus proyectos. Porque sabemos que tú puedes cambiar al mundo, en Analitek...
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