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Secuenciación: Método de degradación química

Secuenciación degradación química

En este método, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los extremos 5´ o 3´ de una o ambas hebras con fósforo 32. Después, la muestra de ADN se divide en cuatro alícuotas y se fragmenta en cuatro reacciones químicas distintas. Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tamaño. Conociendo el nucleótido en el que se realizaron los cortes, se puede inferir la secuencia de la molécula original.

Secuenciación degradación química

Da clic aquí para descargar la imagen del método de degradación química

Ventajas y desventajas

La baja resolución obtenida cuando se reportó la técnica no se debió a un factor inherente al método de Maxam-Gilbert, sino a una limitante de los geles de acrilamida. En un inicio, se consideraba un logro poder diferenciar el tamaño de 250 fragmentos y determinar la secuencia de ese tamaño. El análisis de una secuencia en geles de acrilamida era complicado, ya que no se podía separar los fragmentos grandes. Otro problema que comúnmente afecta la resolución de las bandas obtenidas en el gel es el ensanchamiento de bandas cuyas secuencias favorecen la formación de estructuras secundarias. Para mejorar la resolución del gel se ha reportado que el uso de geles de acrilamida muy delgados, en conjunto con un voltaje alto de corrimiento, produce bandas más delgadas y mejor separadas. Otro aspecto del método de Maxam-Gilbert que puede ser un poco laborioso es la necesidad de separar y analizar individualmente las hebras del ADN que se quiere secuenciar. Esto se puede realizar mediante enzimas de restricción que separen los extremos 20 etiquetados para el análisis. Alternativamente, las dos hebras marcadas pueden ser desnaturalizadas y separadas en un gel.

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Sofía Ramos
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