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Proteómica; fraccionamiento subcelular mediante electroforesis

La caracterización de la expresión de la proteína a nivel de todo el proteóma consiste en la medición cuantitativa de proteínas en una célula en un determinado estado metabólico. Conocer la localización de proteínas en la célula es un dato muy significativo que nos ayuda a explicar su funcionalidad. Por lo tanto, el análisis de las proteínas expresadas en los comportamientos subcelulares provee información referente a la funcionalidad de esta, disminuyendo la complejidad de la muestra.

Los métodos clásicos para separar proteínas consisten en realizar un proceso llamado electroforesis bidimensional (2DE)en gel seguido de un análisis de la imagen producida por el gel. Además de la caracterización también implica una determinación de la composición de aminoácidos, las huellas peptídicas de masas (peptide mass fingerprints) y secuencias utilizando la espectrometría de masas (mass spectrometry o MS). Y finalmente la búsqueda dentro de la base de datos es necesaria para la identificación de proteínas.

La electroforesis bidimensional es una técnica que fue desarrollada en los años 70 por Kenrick y Margolis y O´ Farrell. Esta técnica con gran poder de resolución se caracteriza por separar mezclas complejas de proteínas. Su uso se generalizo a partir de los años 80, tras la invención de un método para generar gradientes de pH inmovilizados (IPG). Los IPG mejoraron la reproducibilidad entre los geles y permitieron la creación de bases de datos de geles bidimensionales.

La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D PAGE) es la herramienta más empleada para el análisis global y la separación de los componentes del proteoma, ya que es químicamente inerte, transparente y estable en un rango amplio de pH’s, temperatura y fuerza iónica.  Dicha técnica permite la separación de cientos o miles de proteínas (“spots”) en un único gel, mostrando un patrón característico.

La Separación de Proteínas mediante 2D PAGE pasa por las siguientes etapas:

El gel corre hacia una dirección sobre un gradiente de pH bajo una condición de no desnaturalizante para separar las proteínas por puntos isoeléctrico para después en una dimensión ortogonal bajo una condición de desnaturalización para separar las proteínas por sus pesos moleculares.

Posteriormente sigue un proceso de tinción que por lo general es muy sensible para revelar la posición de todas las proteínas.

El resultado es un mapa de gel en dos dimensiones que es el porqué de su nombre, donde cada punto en el mapa corresponde a una sola proteína expresada. Posteriormente el mapa de gel puede ser escaneado para llevar a cabo un análisis de la imagen.

La 2DE presenta varias ventajas que explican su notoriedad en los estudios proteómicos. Además de destacar por realizar una visualización directa de los mapas proteicos, permitiendo una fácil identificación de isoformas proteicas, así como la comparación con otros mapas proteicos existentes. Deseas saber más información no olvides contactarnos, Analitek busca responder tus dudas y necesidades, contáctanos y síguenos en nuestras redes sociales y recuerda ¡Tu éxito es nuestra pasión!

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Sofía Ramos
Sofía Ramos

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