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Proteómica; fraccionamiento subcelular mediante cromatografía liquida bidimensional (2D-LC)

protein_structure-Wikimedia-Matt-Howard

La cromatografía líquida bidimensional es motivo de interés y experimentación desde hace ya varios años. La ventaja principal de la cromatografía líquida bidimensional (2D-LC) respecto a la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) radica en la gran capacidad de picos que se puede lograr utilizando diferentes mecanismos separativos, lo que es prácticamente indispensable en muestras complejas por la cantidad y variedad de analitos presentes.

El experimento consiste básicamente en transferir una o varias fracciones del eluyente de una columna cromatográfica a una segunda columna para realizar otra etapa de separación adicional. Esta estrategia puede tener varios objetivos: poder resolver componentes de una mezcla compleja que no puede ser separada en una única columna, para separar la matriz de una muestra respecto de los componentes de interés, para concentrar y purificar algún compuesto particular o hacer uso más eficiente del tiempo de separación.

Cuando hablamos de realizar una caracterización completa de la muestra, hablamos del concepto de “cromatografía multidimensional completa” (traducido del inglés: comprehensive multidimensional chromatography) utilizado por Calvin Giddings por primera vez. Este concepto aplicado a cromatografía bidimensional (2D-LC) significa que cada fracción de la primera columna (el eluyente de la primera columna completo) debe ser analizada en la segunda dimensión. Esto normalmente se implementa juntando fracciones en intervalos de tiempo determinados que luego son analizados en sucesivas corridas en la segunda dimensión.

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Actualmente el uso de 2D-LC como técnica de fraccionamiento ha aumentado su uso, esto debido a la capacidad de superar algunas limitaciones de los métodos de fraccionamiento por electroforesis bidimensional (2DE), lo que permite abordar proteínas difíciles de analizar debido a su estructura y composición, como las proteínas con puntos isoeléctricos extremos (ácidos y bases) y las proteínas hidrofóbicas, puesto que por su composición y su escasa solubilidad se representan de forma mínima en los mapas electroforéticos bidimensionales. Otra ventaja, de la 2D-LC, es que permite las combinaciones multidimensionales para aumentar la capacidad de generar los máximos niveles de resolución para la muestra compleja.

Ahora bien, si queremos una mejor eficiencia para la identificación de proteínas, es necesario mencionar las técnicas cromatográficas conectadas a equipos de espectrometría de masas en tándem, como la tecnología multidimensional de identificación de proteínas (MudPIT), superan a las técnicas basadas en gel, en rapidez, sensibilidad, reproducibilidad y aplicabilidad a diferentes muestras y condiciones. Ademas de poder analizar simultáneamente varias muestras, reduciendo así el tiempo necesario para el análisis de espectrometría de masas.

Los métodos de “2DE” y “2D-LC” presentan sus ventajas y desventajas, con respecto al alcance tecnológico de la técnica, sin embargo, el éxito de un buen análisis está directamente relacionado con la selección adecuada del método a utilizar, tipo de muestra y el estudio a realizar. El uso de cada uno de estos métodos para el fraccionamiento nos aporta resultados complementarios. Recuerda que podemos ayudarte si aún tienes duda de algún equipo que requieras, Analitek busca ayudarte a cambiar el mundo, recuerda que tu éxito es nuestra pasión.

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Sofía Ramos
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