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Genética forense y el flujo de trabajo básico de la secuenciación de nueva generación (NGS)

 

Hoy en día, la mayoría de los laboratorios de análisis de ADN forenses todavía utilizan métodos de PCR y de electroforesis capilar (CE) para el análisis de muestras. Sin embargo, existen numerosas limitaciones en ese enfoque, incluidos los desafíos presentados por el ADN degradado, el ADN de baja cantidad o las mezclas complejas de ADN, que pueden hacer que un caso forense quede sin resolver.

En principio, el concepto detrás de la tecnología NGS es similar a la secuenciación (CE): la polimerasa de ADN cataliza la incorporación de trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) marcados con fluorescencia en una cadena de plantilla de ADN durante los ciclos secuenciales de la síntesis de ADN. Durante cada ciclo, en el punto de incorporación, los nucleótidos se identifican por excitación con fluoróforo. Una diferencia crítica es que, en lugar de secuenciar un solo fragmento de ADN, NGS extiende este proceso a través de millones de fragmentos de manera masivamente paralela.

Podemos observar que existen muchas aplicaciones NGS de las cuales requieren secuenciación de genoma completo (WGS), sin embargo, las aplicaciones genómicas forenses utilizan un enfoque de secuenciación dirigida, esto quiere decir que las secuencias relevantes forenses son dirigidas a través de un flujo de trabajo basado en amplicones. Y cuando hablamos de un flujo de trabajo basado en amplicones, hablamos de Illumina que incluye cuatro pasos básicos:

  • Preparación de la biblioteca: con la secuenciación de amplicones, la biblioteca se prepara realizando una amplificación de dos pasos. El primer paso de la PCR utiliza pares de cebadores etiquetados, específicos de la secuencia, para cada secuencia diana relevante en la muestra de ADN. Durante el segundo paso de PCR, los índices y los adaptadores se incorporan en los amplicones. Las bibliotecas de amplicones se purifican, se agrupan en un solo tubo y se linealizan.
  • Generación de clusters: durante la generación de grupos, la biblioteca se inyecta en una celda de flujo donde los fragmentos se capturan en un césped de oligos unidos a la superficie complementarios a los adaptadores de la biblioteca. Cada fragmento se amplifica luego en grupos clónicos distintos a través de la amplificación del puente. Con la generación de clústeres completa, las plantillas están listas para la secuenciación.

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  • Secuenciación: la tecnología Illumina SBS utiliza un método reversible basado en terminador que detecta bases individuales a medida que se incorporan en las hebras de la plantilla de ADN. Dado que los cuatro dNTPs reversibles unidos por terminador están presentes durante cada ciclo de secuenciación, la competencia natural minimiza el sesgo de incorporación y reduce considerablemente tasas de error en bruto comparadas con otras tecnologías. El resultado es una secuenciación de base por base altamente precisa que elimina virtualmente los errores específicos de contexto de secuencia, incluso dentro de regiones de secuencia repetitiva y homopolímeros. La calidad y precisión de los datos de NGS son importante en genómica forense, particularmente cuando se informan resultados para muestras de ADN mixtas, heteroplasmia de ADNmt o datos de SNP.
  • Análisis de datos: durante el análisis y la alineación de los datos, las lecturas de secuencia se alinean con un genoma de referencia. Tras la alineación, son posibles diferentes tipos de análisis, como el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), la tipificación de STR, el análisis de ADNmt, el análisis filogenético o metage nómico, y más.

Recuerda que la tecnología de secuenciación de Illumina por síntesis (SBS) ofrece un enfoque masivamente paralelo para secuenciar los amplicones de PCR y permite a los científicos forenses de todo el mundo aprovechar todo el poder de la secuenciación de próxima generación (NGS) dirigida. Con el mayor rendimiento de lecturas sin errores, el mejor rendimiento en las regiones de secuencia repetitiva y el precio base por base más bajo, la secuenciación SBS de Illumina es la química más ampliamente adoptada en la industria.

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Sofía Ramos
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