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¿Cuáles son los controles para un experimento cuantitativo mediante QPCR?

Recientemente, uno de los principales objetivos al utilizar QPCR (PCR cuantitativa o en tiempo real) es determinar la cantidad absoluta de la secuencia diana presente en la muestra o controlar los cambios de pliegue de la expresión génica en respuesta a las condiciones experimentales. El uso de cualquier enfoque empleado por el sistema QPCR debe emplear controles positivos y negativos apropiados para cada experimento en tiempo real.

 Según el ensayo que se necesite variarán los tipos de controles, aunque hay ciertos controles que deben ser incluidos en cada ejecución sin importar que clase de experimento sea, como por ejemplo, los controles no templados (NTC).

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 En el caso de los controles positivos, ayudan a identificar falsos negativos que podrían ocurrir debido a la calidad de la plantilla de muestra, típicamente son asociados con muestras heterogéneas tales como detecciones de patógenos o de mutaciones en el genoma. La inclusión de los controles positivos en toda reacción de amplificación, garantiza la ausencia de detección del blanco de interés como una muestra negativa verdadera.

 Los controles negativos frecuentemente pasan desapercibidos en el diseño experimental, pero son uno de los componentes más importantes de un ensayo QPCR. Dependiendo del tipo de control negativo que se emplee, se puede probar los problemas que podrían ocurrir en la reacción en pasos múltiples. Además, usan plantillas de fuentes que se espera que no contengan secuencia de interés como los controles de plantilla (NTC), controles transcriptasa reversa (RT no), los controles de no amplificación (NAC) y los controles de sonda (NPC)

 Cuando se realice una QPCR es necesario incluir por lo menos, tres NTC, o tres controles negativos específicos del colorante, para determinar si estadísticamente o no se ha producido una amplificación real. Por consiguiente, el software basa un resultado positivo o negativo en una prueba con el valor de p, con el fin de determinar si son significativamente amplificados.

 El valor p es la probabilidad de que la media de un conjunto de datos de muestra sea diferente de la media de otro conjunto de datos de muestra. Si el valor de p excede el nivel de confianza especificado por el usuario, el control negativo se llama positivo y se indica con un signo más (+). De lo contrario, el control se llama negativo (es decir, no se detecta diferencia) y se significa con un signo menos (-).New Call-to-action

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Sofía Ramos
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